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科研大神說,Western Blot是研究僧的勞斯萊斯...-北京博奧森生物技術(shù)有限公司
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科研大神說,Western Blot是研究僧的勞斯萊斯...
發(fā)表者:北京博奧森生物      發(fā)表時(shí)間:2020-5-22

 
 生物屆有一句名言——Western Blot是研究僧的勞斯萊斯。

Western Blot蛋白印跡)雖然是科學(xué)研究中最為基礎(chǔ)平常的實(shí)驗(yàn),其背景里卻蘊(yùn)含了很多知識(shí),操作過程中也有許多trick,可以說“好的WB結(jié)果是順利畢業(yè)的一半”。
 

1.蛋白樣品制備——千萬(wàn)別garbage in,garbage out

A: 蛋白提?。毫呀庖焖?gòu)氐?,先變性后保存,在不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的情況下盡量選擇較強(qiáng)的裂解液 (RIPA裂解液);蛋白提取要在低溫條件下進(jìn)行,防止蛋白自溶或降解,同時(shí)可以加入適當(dāng)?shù)?a href="http:///prolook_03.asp?id=AI07291447403156&pro37=9" target="_blank">蛋白酶抑制劑以減少蛋白酶的水解作用。磷酸化蛋白提取還需加入蛋白磷酸酶抑制劑,以防止蛋白去磷酸化。

B: 蛋白定量:確定合適的上樣量,最常用的為BCA法 (BCA蛋白定量試劑盒)。


2.電泳SDS-PAGE——合適即完美

A: 制備上樣樣品:根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,選擇變性/非變性上樣緩沖液,上樣前可以適當(dāng)離心。

B: 配制聚丙烯酰胺凝膠:根據(jù)蛋白分子量的大小選擇合適的膠濃度,蛋白分子量小應(yīng)選擇高濃度的膠,蛋白分子量大則選擇低濃度的膠;TEMED和APS促進(jìn)凝膠反應(yīng),一般先加TEMED,后加APS;常溫下半小時(shí)膠可凝固,若天氣寒冷或需加快凝固,可將其置于37℃孵箱中加速凝固;膠最好現(xiàn)配現(xiàn)用,如果需要短暫保存,要用濕潤(rùn)的保鮮膜包好并置于4℃冰箱中。

C: 配制電泳緩沖液:內(nèi)槽電泳緩沖液要現(xiàn)配現(xiàn)用。

D: 根據(jù)蛋白分子量選擇合適的預(yù)染Marker

E: 濃縮膠電壓一般采用100V左右,待溴酚藍(lán)遷移出濃縮膠后再換為200V。

3.轉(zhuǎn)膜——小手抖一抖,條帶變沒有


A: 膠在負(fù)極,膜靠近正極;為防止短路,濾紙不要大過膜【“三明治夾心”如圖示】,夾好膜和凝膠后,確保凝膠、膜和濾紙之間無(wú)氣泡,否則會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全。

B: 轉(zhuǎn)膜緩沖液要提前冷卻,且膠要在轉(zhuǎn)膜緩沖液里平衡一下,防止膠變形,同時(shí)有助于去除影響轉(zhuǎn)膜的雜質(zhì);轉(zhuǎn)膜全程帶手套操作,避免手印污染影響結(jié)果;膜上可以剪一個(gè)小角用來(lái)標(biāo)記正反面。

C: 濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜的電流一般在200-400mA之間,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘,也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)蛋白的分子量大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng),分子量越小則需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。

D: 可使用麗春紅染色液初步檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效率,它與下游WB檢測(cè)完全兼容,無(wú)任何干擾。染色后可以用蒸餾水,PBS或者其他溶液洗去。可用于PVDF膜、硝酸纖維素膜 (NC膜)和醋酸纖維素膜上蛋白的檢測(cè),不適用于尼龍膜上的蛋白檢測(cè)。


4.免疫印跡——接下來(lái)就是見證奇跡的時(shí)刻

A: 常見的封閉液有5%脫脂奶粉BSA封閉液,磷酸化蛋白使用BSA作為封閉液, 脫脂奶粉會(huì)對(duì)磷酸化蛋白檢測(cè)有影響。

B: 封閉時(shí)間和封閉液劑量要足夠,封閉不充分顯色背景會(huì)過深;洗膜時(shí)間要適當(dāng),一般用TBST洗滌5min×3次,過度洗膜會(huì)使信號(hào)減弱;抗體的稀釋倍數(shù)按照產(chǎn)品說明書和實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,抗體濃度不宜過高。

C: 顯色:一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法,A、B發(fā)光液按比例稀釋混合,現(xiàn)配現(xiàn)用。不同蛋白最佳曝光時(shí)間不同,如果同一張膜上不同樣品信號(hào)差異太大,可以嘗試將膜剪開再分別進(jìn)行曝光。

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