目錄
? 前言
? 新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）臨床診斷中RT-PCR方法的假陰性問(wèn)題
?RT-PCR方法對(duì)檢測(cè)設(shè)備或平臺(tái)要求較高
?核酸檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)
?急需快速準(zhǔn)確診斷COVID-19的方法
?COVID-19臨床診斷中抗體檢測(cè)法假陽(yáng)性的原因
?新型冠狀病毒（SARS-COV-2）抗原檢測(cè)法的優(yōu)勢(shì)
?SARS-COV-2抗原快速檢測(cè)試劑盒簡(jiǎn)介
?COVID-19抗原法快速診斷的優(yōu)勢(shì)
前言
2019年底，中國(guó)武漢發(fā)現(xiàn)了新冠綜合癥（COVID-19），其病原體最早由中國(guó)科學(xué)家鑒定為一種不同于以往的新型冠狀病毒，并第一時(shí)間向全球發(fā)布了其全基因序列，病毒最初定名為2019-nCoV。
由于其序列及感染癥狀與2003年引起SARS爆發(fā)的冠狀病毒相似，世界病毒學(xué)會(huì)將其定名為SARS-COV-2。現(xiàn)在，該病毒已經(jīng)引起世界范圍COVID-19大規(guī)模流行，目前已有累計(jì)超過(guò)40萬(wàn)人被確診，死亡人數(shù)超過(guò)1萬(wàn)8千人，這一數(shù)字仍在快速增長(zhǎng)。
COVID-19癥狀表現(xiàn)
面對(duì)來(lái)勢(shì)洶洶的傳染病的大規(guī)模流行，大量人群需要被篩查、確診并做相應(yīng)的處理，臨床對(duì)診斷試劑的需求極為迫切。除口罩、防護(hù)服等醫(yī)療用品外，在武漢疫情早期以及現(xiàn)在的意大利、西班牙等國(guó)都出現(xiàn)了檢測(cè)試劑的巨大缺口。
對(duì)于病原體的檢測(cè)，PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法是可以最早被應(yīng)用的方法。制備病毒核酸特異性引物序列相對(duì)較快，核酸檢測(cè)的理論特異性和靈敏度都很高，因此基于PCR方法的病毒核酸檢測(cè)試劑盒成為此次針對(duì)新冠病毒檢測(cè)最早被開(kāi)發(fā)的試劑盒。
在中國(guó)的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR陽(yáng)性被作為新冠病毒感染的確診證據(jù)之一。然而，在實(shí)際診斷過(guò)程中，核酸法卻暴露出很多問(wèn)題：
假陰性問(wèn)題；
設(shè)備或檢測(cè)平臺(tái)要求較高；
時(shí)間較長(zhǎng)；
新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）臨床診斷中RT-PCR方法的假陰性問(wèn)題
首先，假陰性意味著漏檢，不僅會(huì)導(dǎo)致臨床中對(duì)疑似患者不能快速確診，而且會(huì)使漏檢者成為潛在的病毒傳染源。
其次，據(jù)報(bào)道，甚至出現(xiàn)了多次核酸檢測(cè)陰性而出院的患者又再次復(fù)發(fā)的情況，也很可能屬于假陰性引起的誤診。
理論上核酸檢測(cè)法特異性和靈敏度都是比較高的，低含量的病毒仍可以被檢測(cè)到。造成“假陰性”這一問(wèn)題可能與多種因素有關(guān)，大致分為采樣問(wèn)題、試劑盒問(wèn)題及陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題這樣幾個(gè)方面。
采樣問(wèn)題：
1.1 呼吸道標(biāo)本：
由于新冠肺炎最常見(jiàn)感染肺及下呼吸道（還包括其它組織感染），因此樣本中病毒載量肺泡灌洗液>痰>咽拭子，當(dāng)使用咽拭子采樣時(shí)，病毒載量可能較低，檢測(cè)結(jié)果取決于所用試劑盒的最低檢測(cè)限；
1.2 取樣操作標(biāo)準(zhǔn)化：取樣位置、力度等需要標(biāo)準(zhǔn)化；
1.3 樣本制備及保存：
首先，臨床樣本一般采集量有限，這對(duì)核酸提取存在挑戰(zhàn)。其次，樣本中可能存在多種復(fù)雜成分影響核酸的提取。而如果核酸提取純度低，將影響下游的PCR反應(yīng)，因此當(dāng)病毒總量低時(shí)，容易造成假陰性結(jié)果；
由于呼吸和飲食都通過(guò)咽部，咽部存在大量微生物，樣本采集過(guò)程中會(huì)不可避免混入核酸酶。核酸酶穩(wěn)定性很高，一般的滅菌等清除或抑制試劑很難完全消除酶活性，它會(huì)造成樣本中核酸被降解，核酸檢測(cè)缺乏模板，因而檢測(cè)結(jié)果為陰性；
試劑盒問(wèn)題：
2.1 試劑盒本身設(shè)計(jì)造成的靈敏度問(wèn)題：
由于核酸檢測(cè)試劑盒設(shè)計(jì)時(shí)需要在特異性和靈敏度之間平衡，比如使用多重PCR可以提高特異性，但多對(duì)引物之間的相互干擾可能會(huì)造成靈敏度降低。但如果不使用多重PCR，則一旦所選則的靶位點(diǎn)核酸序列產(chǎn)生突變，就會(huì)造成試劑盒失效。因而檢測(cè)陰性可能與試劑盒的設(shè)計(jì)有關(guān)；
2.2 由于疫情發(fā)展嚴(yán)重，大量試劑廠商在搶時(shí)間生產(chǎn)，這可能造成試劑之間的精準(zhǔn)度有差別。
陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題：
陽(yáng)性病例需要經(jīng)過(guò)綜合判斷，之所以稱(chēng)為“假陰”通常是通過(guò)臨床癥狀等確認(rèn)為陽(yáng)性。但臨床癥狀可能與病程發(fā)展有關(guān)，病程初期及經(jīng)過(guò)抗病毒治療后，病毒載量可能較低，造成核酸檢測(cè)陰性。
RT-PCR方法對(duì)檢測(cè)設(shè)備或平臺(tái)要求較高
在采樣后，核酸檢測(cè)還包括核酸提取和PCR擴(kuò)增兩個(gè)步驟，所采用的試劑盒和設(shè)備包括核酸提取試劑盒、熒光探針、以及熒光RT-PCR儀等。高靈敏度的RT-PCR儀價(jià)格不菲。
另外，為避免空氣中各種微生物可能帶有的核酸酶的影響，核酸檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的潔凈度要求也較高。
最后，核酸檢測(cè)是一項(xiàng)精密的實(shí)驗(yàn)，對(duì)操作人員的要求也較高，需要經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)的操作培訓(xùn)。這使得在大規(guī)模疫情爆發(fā)時(shí)，各大醫(yī)院具有核酸檢測(cè)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室很快被飽和，大量樣本堆積無(wú)法及時(shí)獲得檢測(cè)。
核酸檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)
完成一個(gè)RT-PCR的檢測(cè)通常需要4-6個(gè)小時(shí)，然而考慮到樣本運(yùn)輸、大量樣本積壓的情況，通常最快24小時(shí)才可以報(bào)告結(jié)果。
據(jù)報(bào)道，在湖北，將樣本送到實(shí)驗(yàn)室要花幾個(gè)小時(shí)，而結(jié)果的發(fā)布要花幾天時(shí)間。當(dāng)?shù)匦l(wèi)生部門(mén)表示，這些實(shí)驗(yàn)室每天可以進(jìn)行6千個(gè)檢測(cè)，但是工作人員全天候工作，也沒(méi)有足夠的實(shí)驗(yàn)室能夠應(yīng)付這樣的工作量。
急需快速準(zhǔn)確診斷COVID-19的方法
由于核酸檢測(cè)在診斷中所暴露出的問(wèn)題，除CT等臨床癥狀指標(biāo)外，臨床醫(yī)生急需一種能夠快速診斷COVID-19的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)人群的大規(guī)模篩查。
《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中，將病人血清學(xué)指標(biāo)，針對(duì)新冠病毒的特異性抗體IgM或IgG陽(yáng)性，作為診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，該方法被稱(chēng)為抗體檢測(cè)法。
抗體檢測(cè)法基于人體對(duì)于外源病原體的免疫反應(yīng)。當(dāng)感染病原體后，人通常在7-10天在血清中出現(xiàn)針對(duì)該免疫原的特異性抗體IgM，它們是機(jī)體抗感染的“先頭部隊(duì)”。如果血清中檢出病原體特異性IgM，提示新近發(fā)生感染，可用于感染的早期診斷。通常在20天后，可以檢測(cè)到針對(duì)病原體的特異性IgG。
(人體在病原刺激后的體液免疫反應(yīng)曲線)
然而在實(shí)際診斷過(guò)程中，抗體檢測(cè)法卻暴露出多種問(wèn)題，不能單獨(dú)作為診斷指標(biāo)用于篩查，只能作為當(dāng)核酸檢測(cè)為陰性時(shí)的輔助診斷方法。
在FDA的SARS-COV-2檢測(cè)指導(dǎo)中明確指出，抗體檢測(cè)不能單獨(dú)用于新冠病毒診斷，不能排除感染或說(shuō)明感染狀態(tài)。有其它病毒如HKU1、NL63、OC43或229E等的既往或現(xiàn)時(shí)感染時(shí)抗體檢測(cè)也可能呈陽(yáng)性。
FDA新冠病毒檢測(cè)指導(dǎo)（Issued on the web on March 16, 2020.）
COVID-19臨床診斷中抗體檢測(cè)法假陽(yáng)性的原因
首先，假陽(yáng)性診斷將使得未感染的人被送至隔離點(diǎn)，有可能造成感染，其密切接觸者被隔離，也造成社會(huì)資源的浪費(fèi)。
SARS-COV-2（或2019-nCoV）特異IgM和IgG抗體檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因是什么？根據(jù)國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心的分析，主要是由于陽(yáng)性判斷值的設(shè)定、樣本的內(nèi)源和外源干擾物質(zhì)造成。但從根本上講，是由于大部分抗體檢測(cè)試劑盒在方法學(xué)上的固有缺陷造成的。
1、 陽(yáng)性判斷值的設(shè)定
每種檢測(cè)試劑盒在研發(fā)時(shí)，都需要通過(guò)對(duì)大量陰性和陽(yáng)性樣本的檢測(cè)，得出檢測(cè)結(jié)果分布圖，如下圖所示。陰性和陽(yáng)性樣本的檢測(cè)值往往會(huì)有一定交疊，這意味著一部分弱陽(yáng)性結(jié)果實(shí)際上為假陽(yáng)性。因此，需要設(shè)定合理的陽(yáng)性判斷值，以減少假陽(yáng)性的產(chǎn)生；
2、 樣本中的干擾物質(zhì)
2.1 內(nèi)源性干擾
內(nèi)源性干擾物質(zhì)一般包括類(lèi)風(fēng)濕因子、嗜異性抗體、補(bǔ)體、因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig抗體等。在日常的臨床血清（漿）樣本中，有相當(dāng)比例的樣本不同程度的含有上述各種干擾物質(zhì)，從而可能導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果的假陽(yáng)性。
2.2 外源性干擾
外源性干擾物質(zhì)包括樣本溶血、樣本被細(xì)菌污染、貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和凝固不全等。
3、采樣時(shí)間窗問(wèn)題
由于機(jī)體體液免疫發(fā)生的時(shí)間因人而異，采樣時(shí)待檢人員血清中病毒特異性IgM或IgG的水平可能處于不同的階段，會(huì)造成檢測(cè)假陰或假陽(yáng)性問(wèn)題。
4、方法學(xué)缺陷
大部分抗體檢測(cè)試劑盒采用捕獲法ELISA原理實(shí)現(xiàn)對(duì)特異性抗體的檢測(cè)。即通過(guò)抗IgM/IgG的抗體，捕獲樣本中的IgM或IgG。如果是病原體特異性的IgM或IgG，它將結(jié)合帶有標(biāo)記的抗原，從而在試紙條的檢測(cè)線或96孔板的相應(yīng)孔中顯現(xiàn)出來(lái)。
由于捕獲抗體（抗IgM/IgG抗體）會(huì)結(jié)合血清中的任何IgM或IgG，因此該方法的特異性?xún)H基于一對(duì)抗原-抗體的特異性識(shí)別和結(jié)合（即血清中的抗體識(shí)別試劑盒所提供的病毒蛋白）。這造成了在復(fù)雜的樣本成分中，由于非特異性結(jié)合而引起的假陽(yáng)性
捕獲法ELISA原理圖
新型冠狀病毒（SARS-COV-2）抗原檢測(cè)法的優(yōu)勢(shì)
抗體識(shí)別和結(jié)合抗原上的某個(gè)表位（或抗原決定簇），如果這個(gè)表位序列與其它非靶點(diǎn)蛋白的某段序列或表位相似，則可能造成抗體與非靶點(diǎn)蛋白結(jié)合，這稱(chēng)為交叉反應(yīng)（Cross-reactivity）。交叉反應(yīng)是免疫反應(yīng)普遍存在的一種現(xiàn)象。
交叉反應(yīng)
如果使用兩種抗原特異性抗體去識(shí)別和結(jié)合一個(gè)靶點(diǎn)抗原的不同表位，則可以大大降低這種交叉反應(yīng)的幾率。簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)描述就是，假設(shè)一個(gè)抗體與非特異靶點(diǎn)的交叉反應(yīng)幾率為1/100，當(dāng)使用兩種不同表位抗體識(shí)別時(shí)，這個(gè)幾率將降為1/10000。兩種抗體檢測(cè)一種抗原的檢測(cè)方法被稱(chēng)為雙抗夾心法，抗原檢測(cè)試劑盒多采用這種方法。
雙抗夾心法ELISA原理圖
SARS-COV-2抗原快速檢測(cè)試劑盒簡(jiǎn)介
依據(jù)雙抗夾心ELISA原理，通過(guò)免疫層析技術(shù)制備的新冠病毒抗原快速檢測(cè)試劑盒核心組成如下圖所示，樣本滴加在樣本墊上，通過(guò)液相層析依次通過(guò)結(jié)合墊，NC膜上的檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線）。
抗原快速檢測(cè)試紙條示意圖
結(jié)合墊內(nèi)含有標(biāo)記的抗原特異性抗體，可以與樣本中的抗原（病毒蛋白）發(fā)生結(jié)合，當(dāng)液流到達(dá)檢測(cè)線（T線）時(shí)，固定在這條線上的第二種抗原特異性抗體再次與抗原結(jié)合，將會(huì)呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。質(zhì)控線（C線）包被IgG抗體，可以結(jié)合樣本墊中抗體，用于判斷層析過(guò)程是否順利。
抗原檢測(cè)試劑盒反應(yīng)原理
下圖分別顯示陽(yáng)性、陰性和測(cè)試失敗的情況。如果質(zhì)控線（C線）未顯色，則測(cè)試失敗，需要重新檢測(cè)。
抗原檢測(cè)試劑盒結(jié)果判斷
COVID-19抗原法快速診斷的優(yōu)勢(shì)
為滿(mǎn)足快速診斷的需求，利用免疫層析技術(shù)開(kāi)發(fā)的快速檢測(cè)試劑盒具有很多優(yōu)點(diǎn)：
快速：
檢測(cè)一個(gè)樣本僅需10-15分鐘，可以做到現(xiàn)場(chǎng)快檢。RT-PCR方法需要4-6小時(shí)才能得到檢測(cè)結(jié)果，且由于設(shè)備等原因，不能做到現(xiàn)場(chǎng)快檢。
操作簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊設(shè)備和人員培訓(xùn)：
RT-PCR方法檢測(cè)需要熒光定量PCR儀。
特異性高：
雙抗夾心法保證了抗體交叉反應(yīng)低，從而有效提高了免疫學(xué)方法的特異性，減少假陽(yáng)性的發(fā)生。
靈敏度穩(wěn)定：
理論上，由于核酸檢測(cè)可以將病毒模板擴(kuò)增，其靈敏度高于免疫學(xué)檢測(cè)方法。但在實(shí)際臨床使用中，由于前述對(duì)樣本制備的要求較高，造成核酸法診斷假陰性較高。而免疫學(xué)方法對(duì)樣本的要求相對(duì)較低，抗原蛋白較穩(wěn)定，因而抗原檢測(cè)試劑盒靈敏度表現(xiàn)穩(wěn)定。
新型冠狀病毒綜合癥（COVID-19）實(shí)驗(yàn)室診斷方法比較：
總之，新型冠狀病毒（SARS-COV-2）抗原檢測(cè)法可有效減少RT-PCR法的假陰性和抗體檢測(cè)法的假陽(yáng)性問(wèn)題，診斷快速、準(zhǔn)確、對(duì)設(shè)備和人員要求低，其特點(diǎn)適合大規(guī)模新冠病毒感染疑似病例的快速排查，對(duì)疫情集中暴發(fā)的快速排查非常有效。也可以作為出院病例核酸檢測(cè)的再次確診方法，避免假陰性患者出院造成新的傳播風(fēng)險(xiǎn)。（注：用于臨床需用有證產(chǎn)品）
SARS-CoV-2研究產(chǎn)品推薦
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleoprotein ELISA Kit
SARS-CoV-2 重組N蛋白
| 產(chǎn)品編號(hào) | bs-41408P |
| 英文名稱(chēng) | Recombinant SARS-CoV-2 N Protein (His tag) |
| 序列 | Recombinant SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein (full length) (His tag) |
| 分子量 | 46kDa |
| 純度 | ≥90% |
SARS-CoV-2 重組N蛋白抗體
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英文名稱(chēng) |
產(chǎn)品編號(hào) |
克隆類(lèi)型 |
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Anti-SARS-CoV-2N protein antibody |
Rabbit pAb |
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Mouse mAb |
SARS CoV 相關(guān)產(chǎn)品
重組蛋白產(chǎn)品
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英文名稱(chēng) |
產(chǎn)品編號(hào) |
|
Recombinant SARS N protein |
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Recombinant SARS-CoV-2 N protein-C |
bs-41409P |
|
Recombinant SARS-CoV-2 Spike Protein S1 |
bs-41405P |
| Recombinant SARS-CoV-2 Spike Protein RBD | bs-41407P |
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英文名稱(chēng) |
產(chǎn)品編號(hào) |
克隆類(lèi)型 |
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Anti-SARS spike glycoprotein S1 antibody |
Rabbit pAb |
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Anti-SARS S-protein antibody |
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Anti-SARS putative orflab polyprotein antibody |
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Anti-SARS N antibody |
Mouse mAb |
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ACE2 抗體產(chǎn)品
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英文名稱(chēng) |
產(chǎn)品編號(hào) |
克隆類(lèi)型 |
|
Anti-ACE2
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Rabbit pAb
|
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| bsm-52614R |
Rabbit mAb |
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產(chǎn)品類(lèi)別 |
英文名稱(chēng) |
產(chǎn)品編號(hào) |
克隆類(lèi)型 |
| 抗體 | Anti-SARS-CoV-2 Spike Protein S | bs-24382R |
Rabbit pAb |
| bs-24383R | |||
| bs-24384R | |||
| 重組蛋白 |
SARS-CoV-2 Spike Protein S2 |
bs-41406P |
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