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文章信息

腫瘤聯(lián)合免疫治療在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫和調(diào)節(jié)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境(ITM)方面均顯示出良好的潛力。然而免疫聯(lián)合療法的化學(xué)物理性質(zhì)不同，藥代動(dòng)力學(xué)特征不一致。吲哚菁綠(ICG)模板自組裝置——一種用于制備雙藥合一的納米藥物，實(shí)現(xiàn)了免疫調(diào)節(jié)劑的腫瘤特異性共傳遞。通過ICG模板的紫杉醇(PTX)納米顆粒自組裝(ISPN)，以及ISPN在三陰性乳腺癌(TNBC)聯(lián)合免疫治療中的應(yīng)用進(jìn)行了論證。ISPN通過增強(qiáng)腫瘤的通透性和滯留效應(yīng)，對(duì)ICG和PTX的腫瘤特異性共遞送表現(xiàn)出滿意的膠體穩(wěn)定性和高效性。激光照射后，ISPN的ICG組分通過光動(dòng)力療法激活抗腫瘤免疫反應(yīng)，高效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡。同時(shí)，ISPN抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Tregs)對(duì)抗ITM，釋放PTX。ISPN與免疫檢查點(diǎn)阻斷治療(αPD-L1)結(jié)合使用治療TNBC，顯示出協(xié)同的腫瘤退縮、轉(zhuǎn)移抑制和預(yù)防復(fù)發(fā)作用?？偟膩碚fICG模板的納米藥物在開發(fā)納米藥物平臺(tái)和聯(lián)合免疫療法應(yīng)用方面具有巨大潛力。

研究背景

三陰性乳腺癌(TNBC)是最具高浸潤性和轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤之一?；瘜W(xué)療法是AD臨床治療晚期或轉(zhuǎn)移性TNBC腫瘤的主要方法。然而，由于固有或獲得的多重耐藥性的發(fā)生，化學(xué)療法療效低下的局限性凸顯。前幾年免疫治療，特別是免疫檢查點(diǎn)阻斷治療(ICB)開啟了癌癥治療的新篇章。盡管前景看好，但由于TNBC腫瘤的免疫原性低和免疫抑制性腫瘤微環(huán)境(ITM)，TNBC患者很少受益于當(dāng)前的ICB治療。因此，在改善TNBC免疫治療方面，找到能增強(qiáng)免疫原性并逆轉(zhuǎn)ITM的互補(bǔ)方法仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。ICB療法與化學(xué)療法、光動(dòng)力療法(PDT)或放射療法相結(jié)合，具有協(xié)同抗腫瘤作用，可促進(jìn)腫瘤內(nèi)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)的浸潤并克服ITM。然而，聯(lián)合免疫療法使用不同的免疫調(diào)節(jié)劑，其化學(xué)物理特性和藥代動(dòng)力學(xué)特征不同。盡管基于納米顆粒的藥物遞送系統(tǒng)有望實(shí)現(xiàn)聯(lián)合免疫療法，但目前的納米藥物的制備方案通常過于復(fù)雜，無法實(shí)現(xiàn)可重復(fù)性和質(zhì)量控制。此外，輔料對(duì)于制備載藥納米顆粒是必不可少的，輔料的使用會(huì)導(dǎo)致載藥量降低。近年來，無輔料的納米藥物在高效藥物輸送方面引起了廣泛關(guān)注。當(dāng)前大多數(shù)無輔料的納米藥物已被設(shè)計(jì)為可自行組裝成納米制劑的前藥結(jié)構(gòu)。小分子療法的化學(xué)修飾對(duì)于開發(fā)常規(guī)的無輔料納米粒子至關(guān)重要，但這可能會(huì)削弱抗癌藥的治療性能。鑒于此，作者利用吲哚菁綠(ICG)為模板進(jìn)行自組裝制備二藥合一的納米藥物并用于聯(lián)合免疫療法。該策略可不使用任何輔料而實(shí)現(xiàn)幾乎100％的各種小分子藥物的負(fù)載(圖1a)。為了進(jìn)行概念驗(yàn)證，作者專注于開發(fā)用于TNBC聯(lián)合免疫治療ICG模板自組裝紫杉醇(PTX)納米顆粒(ISPN)(圖1b)。ICG可以進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫原性細(xì)胞死亡(ICD)。ICD的腫瘤細(xì)胞將鈣網(wǎng)蛋白(CRT)暴露在細(xì)胞膜表面，釋放高遷移率族蛋白B1(HMGB1)，并分泌三磷酸腺苷(ATP)啟動(dòng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。同時(shí)，與ISPN共傳遞的PTX通過特異性殺傷調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)來對(duì)抗ITM。PTX是臨床治療TNBC的一線化療藥物之一，它可以穩(wěn)定化微管蛋白并抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂抑制腫瘤生長。相較于PTX的化學(xué)細(xì)胞毒性，一些臨床前和臨床研究表明PTX通過調(diào)節(jié)免疫抑制腫瘤微環(huán)境增強(qiáng)了ICB治療的療效。例如，低劑量的PTX(5mg/kg)通過下調(diào)Tregs有效地逆轉(zhuǎn)了ITM。PTX降低Tregs瘤內(nèi)浸潤，并使細(xì)胞死亡受體Fas(又稱CD95)上調(diào)以此來抑制Tregs的免疫抑制功能。ISPN與免疫檢查點(diǎn)阻斷劑(即抗PD-L1抗體，αPD-L1)結(jié)合使用，在具有TNBC腫瘤免疫能力的荷瘤小鼠模型中顯示出協(xié)同的抗腫瘤性能(圖1c)。綜上所述，ICG模板自組裝納米醫(yī)學(xué)可能是TNBC免疫治療的有力策略。

圖1.用于TNBC腫瘤免疫治療的PTX納米顆粒ICG模板自組裝的示意圖。(a)可供ICG模板化自組裝的小分子藥物庫；(b)PTX納米顆粒的ICG模板自組裝；(c)ISPN介導(dǎo)的癌癥免疫治療示意圖。ISPN聯(lián)合免疫治療聯(lián)合ICB誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ICD，并消除免疫抑制Tregs。

研究結(jié)果之一ISPN的ICD誘導(dǎo)作用

CRT是ICD的主要生物標(biāo)志物，充當(dāng)“吃我”信號(hào)，以誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞吞噬垂死的腫瘤細(xì)胞。由細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可觸發(fā)CRT表達(dá)并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞表面。為了研究ISPN在體外的ICD誘導(dǎo)特性，4T1腫瘤細(xì)胞在含1ug/ml ICG 的ISPN中孵育8h后，808nm激光照射30s。2小時(shí)后CLSM及FC檢測細(xì)胞表面ICR表達(dá)。ICG+L及ISPN均可誘導(dǎo)4TI細(xì)胞表面CRT的上調(diào)表達(dá)(圖2a)，而FCM檢測結(jié)果顯示ISPN + L顯著引起4T1細(xì)胞表面CRT表達(dá)。ISPN+L組CRT表達(dá)是ICG+L組的2倍(圖2b，c)，這可能歸因于ISPN + L大量產(chǎn)生細(xì)胞ROS。接下來，作者通過檢測治療誘導(dǎo)的蛋白HMGB1的轉(zhuǎn)運(yùn)。HMGB1通常分布在細(xì)胞核，在ICD的腫瘤細(xì)胞遷移到細(xì)胞外。胞外HMGB1可作為Toll樣蛋白受體激動(dòng)劑促進(jìn)DC成熟。CLSM結(jié)果顯示HMGB1全部轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外(圖2d)。FCM結(jié)果進(jìn)一步表明ISPN處理的4T1細(xì)胞中HMGB1下降，而激光照射后的4T1細(xì)胞中HMGB1進(jìn)一步降低(圖2e)。為了證實(shí)ISPN的ICD誘導(dǎo)性能，ATP化驗(yàn)檢測ATP分泌。ATP檢測結(jié)果顯示ISPN+L組分別是ICG+L和ISPN組的2.6倍和2.1倍(圖2f)。ISPN表明ISPN能有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的ICD。緊接著作者體外檢測ISPN誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性對(duì)DC成熟的影響，以此評(píng)價(jià)ISPN誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫原性。FCM檢測顯示ISPN+L顯著提高DC成熟(圖2g)。ISPN組的DC成熟頻率約為18.6%，而進(jìn)行了激光放射處理的腫瘤細(xì)胞中提高到了50.1%左右(圖2h)。這些結(jié)果表明ISPN可有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ICD并增強(qiáng)了腫瘤免疫原性以促進(jìn)DC成熟。體外檢測4T1細(xì)胞的ISPN細(xì)胞毒性，基于ICG的PDT治療和PTX的化學(xué)治療可引起部分的腫瘤細(xì)胞死亡。相比之下，ISPN和激光放射治療聯(lián)合可大大降低細(xì)胞的存活能力。ISPN介導(dǎo)的化學(xué)療法和PDT在體外具有累積的抗腫瘤作用。

圖2.體外ISPN的ICD誘導(dǎo)作用。(a)CLSM和(b)FCM檢測在ISPN處理及激光放射后4T1腫瘤細(xì)胞表面CRT分布；(c)FCM檢測4T1細(xì)胞表面CRT表達(dá)；(d)CLSM和(e)FCM檢測ISPN處理的41T細(xì)胞中HMGB1的釋放；(f)ISPN處理的4T1細(xì)胞ATP分泌；(g)ISPN處理的4T1細(xì)胞誘導(dǎo)BMDC成熟的FCM圖(設(shè)門CD11c+)；(h)FCM檢測BMDC成熟率；(i)4T1細(xì)胞體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)(標(biāo)尺=50μm，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

在本研究中，作者證明了小分子藥物的ICG模板自組裝納米顆粒的制備。相較于游離ICG和PTX，整合ICG和PTX的ISPN在荷瘤小鼠的體外血液循環(huán)拉長，腫瘤積累提高。在腫瘤細(xì)胞的體外和體內(nèi)檢測，ISPN通過PDT誘導(dǎo)的ICD有效地誘導(dǎo)抗腫瘤免疫并促進(jìn)CTLs的瘤內(nèi)浸潤。同時(shí)，ISPN極大地抑制了Tregs的招募，從而解除ITM。綜上所述，通過制備ICG模板的小分子藥物自組裝納米顆粒，結(jié)合ICB治療顯示出累積的抗腫瘤性能，可抑制腫瘤生長并抑制肺轉(zhuǎn)移，同時(shí)能防止腫瘤復(fù)發(fā)。最重要的是ICG模板自組裝容易擴(kuò)展到其他小分子藥物。本研究展示了ICG模板自組裝策略在開發(fā)無輔料納米藥物和聯(lián)合免疫療法方面的潛力。

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